Диагностика активности эндотоксина

Обычно, для пациентов с подозрением на сепсис, оперативные терапевтические решения принимаются на основании оценки физиологических параметров, таких как температура тела, уровень лейкоцитов в крови, показатели гемодинамики еще при отсутствии объективных признаков инфекции или эндотоксемии.

Эндотоксин считается самым ранним и мощным медиатором микробного происхождения, участвующим в патогенезе сепсиса и септического шока, поэтому быстрое и количественное определение его присутствия даёт врачам важнейший инструмент в определении возможной причины и степени тяжести септического процесса.

Анализ активности эндотоксина (Endotoxin Activity Assay - EAA), является первым и единственным количественным анализом, утвержденным Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA).

Являясь быстрым и надежным методом количественного анализа, ЕАА позволяет врачам проверять образцы цельной крови и измерять содержание эндотоксина с высокой степенью чувствительности. EAA помогает врачам выявить пациентов с высоким риском развития тяжелого сепсиса. Раннее распознавание пациентов с сепсисом и своевременное вмешательство с целью назначения направленного лечения обеспечивает значительные преимущества метода с точки зрения благоприятного исхода для пациента.

Принцип анализа ЕАА.
Основным реагентом ЕАА являются антиэндотоксинные антитела – иммуноглобулин М. Если эндотоксин присутствует в образце крови, он распознается и связывается антителами, после чего распознаётся комплементными рецепторами и поглощается нейтрофилами. В присутствии зимозана в нейтрофилах пациента происходит усиленный респираторный взрыв, который определяется методом люминол-зависимой хемолюминисценции. Количество испускаемого света пропорционально количеству эндотоксина, присутствующего в образце крови.

Проведение теста.
Образец крови пациента вносится в три пробирки из набора для определения уровня активности эндотоксина. В пробирке 1 измеряется базальная активность в отсутствие специфичных антиэндотоксинных антител – это активность нейтрофилов на исходном уровне для данного пациента. В пробирке 3 измеряется максимальный окислительный взрыв нейтрофилов пациента в ответ на избыток экзогенного эндотоксина – это максимальная активность нейтрофилов для данного пациента. Пробирки 1 и 3 используются в качестве внутреннего контроля. В пробирке 2 выполняется измерение уровня активности в образце в присутствие комплекса эндотоксин-антитело.

           

Испускание света из трех пробирок улавливается хемилюминометром. Этот прибор рассчитывает уровень активности эндотоксина и отображает результаты в виде активности эндотоксина или в единицах ЕАА. Такова сущность анализа активности эндотоксина.

Клиническая ценность ЕАА™

Проспективное мультицентровое исследование по Определению Эндотоксина при Критических Состояниях (MEDIC) было проведено в 10 отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) в академических клиниках Северной Америки и Европы.

Наличие эндотоксемии оценивали в первый день пребывания пациентов в ОРИТ, чтобы определить вероятность развития тяжелого сепсиса в течение 24 часов после поступления. Целевые группы для Оценки Риска включали пациентов (N = 857), поступивших в программу MEDIC в первый день пребывания в ОРИТ.

Было обнаружено, что эндотоксемия распространена в весьма разнородной популяции критически больных пациентов: почти половина всех пациентов имела уровень циркулирующего эндотоксина, более чем на 2 стандартных отклонения выше уровня, обнаруживаемого у здоровых субъектов в контрольной группе. Однако в исследуемой группе только 4% имели грамотрицательную инфекцию в соответствии с критериями Центра по Контролю над Заболеваниями. Хотя эта разница могла быть вызвана внутренними причинами при документировании инфекции у критически больных пациентов, предположительно, что эндотоксины могли поступать из других источников.

Пациенты, имевшие средний или повышенный уровень активности эндотоксина (0,40–0,59) в день приёма в ОРИТ были в явно более тяжелом состоянии, что выразилось в повышенных уровнях APACHE II и более высокой распространенности тяжелого сепсиса. Кроме того, больные с высоким уровнем активности эндотоксина (>0,60), имели значительно повышенный риск смерти в блоке интенсивной терапии. Таким образом, наличие эндотоксикоза определяет высокий риск у субпопуляции больных в тяжелом состоянии.

Критерий отсутствия грамотрицательной инфекции

ЕААTM является тестом на активность эндотоксина с численной границей отсутствия грамотрицательной инфекции, установленной на уровне 0,40. В ходе исследования MEDIC грамотрицательная инфекция была выявлена в культуре у 36 из 465 (8%) исследованных пациентов. Результаты с показателем ЕААTM менее 0,40 (0,00–0,39) подтвердили отсутствие грамотрицательной инфекции у пациентов ОРИТ, подозреваемых на наличие инфекции.

Резюме

Хемилюминесцентный тест с применением цельной крови обеспечивает следующие преимущества: он прост, чувствителен и позволяет изучать функции нейтрофилов непосредственно в крови. ЕААTM более избирателен и более точно отражает результаты взаимодействия с посредником в естественной среде. Обеспечивая врачей надежной и своевременной информацией, ЕААTM помогает выделить пациентов с высоким риском тяжелого сепсиса и извлечь максимальную пользу от ранней целенаправленной терапии.

Часто задаваемые вопросы

Почему в анализе используется цельная кровь?

  • Цельная кровь усиливает чувствительность анализа на эндотоксин более чем в 1000 раз по сравнению с пробами разведёнными в буферах.
  • Реагенты LBP и ВСС-14 разрушают LPS и облегчают связывание Липида А антителом.

Есть ли риск загрязнения при проведении теста?

  • По сравнению с LAL, ЕАА™ является тестом, гораздо менее чувствительным к загрязнению, потому что только прямое заражение крови будет иметь наибольшее влияние на ложноположительный результат. В LAL любой из реагентов примерно одинаково подвержен риску загрязнения.

Почему используются пробирки типа "МАХ"?

  • Активность эндотоксина выражается в условных единицах, полученных из интегрального отклика образца (хемилюминесценции) за период времени, и калибровка проводится так, что 0 единиц отражает активность эндотоксина в отсутствие антител, а 1,0 отражает активность после добавления максимальной воздействующей дозы ЛПС (4600 пг/мл).

Можно ли использовать гепаринизированные пробирки?

  • Проблема гепаринизированных пробирок - это вероятность загрязнения гепарин эндотоксином. Это уже было описано в исследованиях. Кроме того, хранение с ЭДТА предотвращает гомотипическую агрегацию некоторых клеток и больше подходит для хемилюминесценции.

Видео "Экспресс диагностика активности эндотоксина в цельной крови"